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CRISPR/Cas9转基因

CRISPR/Cas9转基因


CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项能够实现靶向性地突变目标序列、对目标基因进行knockout、修饰以及定点knockin的重要技术,已被证明在酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、人类(细胞)等许多物种中都能发挥作用。CRISPR/Cas9以其设计操作简单、经济、高效的优点超越了传统的基因靶向技术基因组编辑技术,成为科学界的新宠。

 

CRISPR/Cas系统是一种存在于大多数细菌和古细菌中的后天免疫系统,能够靶向性地切割外源DNA,从而抵御噬菌体或质粒的入侵。CRISPR全名成簇、规律间隔短回文重复序列(Clustered regullarly interspaced short palindromic repeatsCasCRISPR相关蛋白的缩写(CRISPR-associated proteins) 。CRISPR/Cas系统有3种类型,其中CRISPR I I型研究最为清楚,主要由Cas9核酸酶蛋白、crRNACRISPR RNA)及tracrRNAtrans-activating CRISPR RNA,反式作用CRISPR RNA,)组成。CRISPR II型系统发挥作用的过程可分为4个步骤(图1):(1) crRNAtracrRNACRISPR基因座转录出来;(2) tracrRNA结合pre-crRNA(前体crRNA)上的重复序列,并介导pre-crRNA被加工成为成熟crRNA(3) 成熟crRNA-tracrRNA复合体结合Cas9,并将cas9引导至crRNA(通过Waston-Crick配对规则)所识别的目标区域;(4) Cas9对目标区域进行切割,形成DNA双链缺口(DSBdouble-stranded break)。




1 CRISPR/Cas9系统作用机制

整个过程的4个步骤可简单描述为转录-->加工-->识别-->切割


2012年,认识到CRISPR/Cas9系统在基因组编辑方向上的巨大潜力,Jinek等人将crRNAtracrRNA序列经过改造整合成一个嵌合体RNAsingle RNA chimera——这种嵌合体分子后来也被称为single guide RNAsgRNA)或guide RNAgRNA——通过体外实验证明它能够取代crRNA:tracrRNA复合体,与Cas9蛋白相互作用并介导序列特异性的切割(图2)。从而将CRISPR/Cas9三元系统简化为二元系统,为进一步开发更为简单、通用的基因组编辑技术奠定了重要的基础。


2 guideRNA的改造


2013年,几个不同实验室团队都发表文章报道,CRISPR/Cas9系统能被用对果蝇基因组进行修饰——产生indel突变、大片段删除(gene knockout)以及同源重组介导的基因替换或插入(图3)。表达1gRNA,能够引导Cas9切割基因组产生1个双链缺口,而非同源末端连接(NHEJ)的不精确修复,往往造成小片段的插入缺失(short indel and deletion,即indel),从而可能造成基因的移码突变或无义突变;若同时表达2gRNA,并且在基因组上识别位点距离合适,能够通过Cas9切割产生2个双链缺口,最终造成大片段DNA的删除;另外,利用Cas9产生的双链缺口,引入带有缺口附近同源序列的模板,能够实现外源片段(基因或标记物等)的插入。

利用DNA双链缺口的修复机制对基因组进行3种类型的修饰




目前,我们已经建立起较完备的CRISPR/Cas9转基因服务平台,能够提供方案设计(gRNA序列设计、同源臂设计等)、注射样品制备(gRNA质粒构建、同源序列质粒构建、 gRNACas9 mRNA合成)、转基因注射、转基因筛选及分子鉴定的整体打包服务,也可以根据客户需求提供拆分服务。


脚注信息
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