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果蝇转基因概述

自从20世纪初,果蝇第一次被Thomas Hunt Morgan带进实验室进行生物学研究,至今已有100多年的历史。果蝇以其个体小、生活周期短、易操作等优点,为生物学家所青睐,并被广泛地应用于遗传、演化、发育生物学等多个领域的研究。果蝇还以微小的身躯支撑起了诸多重量级的生物学发现:Thomas H. Morgan基于白眼等突变体果蝇的研究,提出了染色体学说——染色体是遗传物质的载体,基因在其之上线性地排列,而获得1933年诺贝尔奖;Morgan的学生Hermann J. Muller因发现X ray可导致果蝇发生突变,而获得1946年诺贝尔奖;Edward B. LewisChristiane Nüsslein-VolhardEric F. Wieschaus三人因揭示了果蝇胚胎早期发育的遗传调控机制(这种机制在其他高等动物中也是保守的,为一些发育相关疾病的研究提供了重要的参考),而获得1995年诺贝尔奖;Richard AxelLinda B. Buck因在果蝇中发现了嗅觉受体,以及揭示了嗅觉系统的组织形式,而获得2004年诺贝尔奖;Jules A. Hoffmann,因在果蝇中发现Toll基因对于先天免疫的重要作用(后来发现Toll基因在哺乳动物中也是保守的),与另外两位科学家分享了2011年诺贝尔奖。

除了果蝇自身的优点,科学家们还在果蝇身上开发了一系列重要的工具:比如Gal4/UAS系统、FRT/FLP系统、mosaic分析方法、转基因技术(随机插入、定点插入、利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑)等等,加上果蝇基因组(包括近缘物种)、转录组的质量高且丰富的注释信息,蝇全已被全副武装成一个多功能战士,在更多的新兴领域(比如行为、神经疾病、糖尿病、衰老、癌症等)开疆拓土。

其中,转基因技术更是研究果蝇基因结构、功能和调控所必不可少的重要工具。利用转基因可以实现基因的敲除或拯救、表达的上调或下调,追踪基因表达的时期和部位,条件性(特定的时空)地表达目的基因或操作特定类群的细胞等等。芳景生物致力于打造三个主要的转基因技术平台:转座子介导的随机插入转基因、PhiC31介导的定点插入转基因以及CRISPR/Cas9基因组编辑技术,高效可靠地为我国科研工作者设计、提供果蝇研究所需的转基因果蝇品系,加速科研成果的产出和转化,提升我国在果蝇研究领域的国际竞争力。

 

果蝇转基因基本流程

整个转基因流程可以分为4个步骤:注射样品制备、胚胎显微注射、转基因筛选和分子鉴定(见图1)。

 

 

  转基因基本流程


1. 样品制备

对于P因子和PhiC31转基因,需要先将外源DNA片段克隆到特定的载体上(载体要对应特定的转基因类型、并带有筛选的marker),构建好donor质粒。然后将donor质粒转化到细菌里进行扩增,并进行质粒中提。

另外,对于CRISPR/Cas9转基因,样品可以以两种形式提供:(1) donor质粒 + gRNA 质粒;(2) donor质粒 + gRNA RNA + cas9 mRNA。其中,前者用于注射表达Cas9基因的品系;后者可以直接注射野生型品系或者客户指定的品系(注射品系不需要表达Cas9)。

针对不同的转基因类型,样品的要求总结如下:

 

转基因样品要求


 

 

我们可以提供质粒的转化+中提、DNA样品纯化、载体构建、gRNA RNACas9 mRNA合成等样品制备服务,客户可根据需要进行选择(详细信息请参考具体类型的转基因服务介绍)。

 

 

2. 显微注射

我们具备成熟的果蝇胚胎显微注射平台,能够完成果蝇显微注射所需要的一整套流程(见图2

准备图片:拉针、胚胎收集、摆胚胎、注射、保湿、挑幼虫、分雌雄进行杂交、筛选红眼(或者荧光)

 

3. 转基因筛选

对于注射好的P0代果蝇,我们将其与野生型果蝇(比如:w1118,yw或者客户指定的品系)或balancer品系果蝇(比如:FM7aBc/CyoTM3/TM6,或客户指定的品系)进行杂交,从后代F1中筛选带有转基因标记(比如红眼或荧光)的果蝇。

 

4. 分子鉴定

对于筛选得到的F1转基因果蝇,还需要进一步通过分子鉴定来检测外源片段是否完整地插入果蝇基因组,或验证外源片段是否插入到基因组上预期的位置。针对不同的转基因类型需要设计不同的鉴定方案。

特别地,对于CRISPR/Cas9转基因,我们针对IndelKnockoutKnockin等不同的转基因类型,分别制定了一套成熟的杂交+分子鉴定流程,能够快速地鉴定突变,目前具备多例CRISPR分子鉴定的成功经验(见图2和图3)。详细信息请参考具体类型的转基因服务介绍。

  

图1 CRISPR  Indel案例

P0代果蝇目的片段测序结果(峰图)杂峰区域为indel突变发生区域

 


 

  图2 CRISPR Knockout案例

(A). KO突变体电泳结果 (B). KO突变体测序比对结果

 

脚注信息
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