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Cell:首次利用CRISPR-Cas9靶向活细胞中的RNA
作者:管理员    发布于:2016-03-29 11:29:55    文字:【】【】【

来源:生物谷 2016-03-21 15:52

2016年3月21日/生物谷BIOON/--储存于DNA中的遗传密码决定着包括从我们眼睛的颜色到我们的疾病易感性在内的一切。这已激励着科学家们对人类基因组进行测序,并开发出改变这种遗传密码的方法,但是很多疾病也与一种不同的基础生物分子(即RNA)相关联。鉴于RNA携带来自细胞核中的遗传密码,科学家长期以来就一直在寻求一种方法高效地靶向作用于活细胞中的RNA。如今,在一项新的研究中,来自美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员通过将一种流行的DNA编辑技术CRISPR-Cas9应用到RNA上而实现这一壮举。相关研究结果于2016年3月17日在线发表在Cell期刊上,论文标题为“Programmable RNA tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9”。

论文通信作者、加州大学圣地亚哥分校细胞与分子医学副教授Gene Yeo博士说,“据我们所知,这项研究是首次利用CRISPR-Cas9靶向作用于活细胞中的RNA。我们当前的研究着重追踪RNA在活细胞内的运动,但是未来的[进一步]开发可能能够让科学家”测量其他的RNA特征或者开发出治疗方法校正导致疾病的RNA行为。”

RNA在细胞中的位置---它如何和何时到达这个位置---能够影响蛋白是否在合适位置和适合时间产生。比如,在大脑突触中起着重要作用的蛋白是由位于突触的RNA产生的。RNA转运缺陷与包括从自闭症到癌症在内的很多疾病相关联,因此科学家需要测量RNA运动的方法以便开发出治疗这些疾病的方法。

编辑和测量DNA---作为改变蛋白产生、研究其背后的生物学机制以及校正这些缺陷治疗疾病的手段---的努力在过去几年取得重大进展。这正是科学家发现他们能够选择CRISPR-Cas9并且利用它编辑哺乳动物系统中的基因的时候。

正常情形下,CRISPR-Cas9是这样工作的:设计一种与特异性靶基因序列相匹配的向导RNA(gRNA)。这种gRNA引导Cas9酶到基因组所需编辑的位点上并在那里切割靶基因DNA序列。细胞不准确性地修复这种DNA断裂,因而让这种基因失活,或者利用经过校正的基因版本替换切口附近的DNA片段。

在此之前,CRISPR-Cas9只能被用来操纵DNA。在这项新的研究中,Yeo和同事们基于这种技术开发出一种灵活的靶向作用于活细胞中RNA的方法,该方法也被称作RNA靶向Cas9(RNA-targeted Cas9,RCas9)。

为了靶向作用于RNA而不是DNA,研究人员改变CRISPR-Cas9系统的几种特征。基于论文共同作者、加州大学伯克利分校研究员Jennifer Doudna博士之前的研究,研究人员设计出一种短的被称作PAMmer的核酸片段,它与gRNA一起将Cas9引导到RNA分子上。

为了测试这种新的系统,Yeo和同事们利用它靶向作用于编码蛋白ACTB、TFRC和CCNA2的RNA。他们随后观察与一种荧光蛋白融合在一起的Cas9,结果揭示出RNA迁入应激颗粒(stress granules)---当细胞处于应激时,在细胞胞质中形成的蛋白和RNA簇集物---内部。应激颗粒与诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)之类的神经退行性疾病相关联。这一系统允许他们在一段时间内在活细胞中追踪RNA,同时不需要其他RNA追踪技术中经常使用的人工标记物,而后者通常会干扰正常的细胞过程。

论文第一作者、Yeo实验室加州大学圣地亚哥分校雅各布工程学院研究生David Nelles说,“CRISPR-Cas9因能够靶向结合和修饰人类DNA而正在引发基因组学和医学变革。DNA是生命的基本构造元件。我们才刚开始观察利用CRISPR-Cas9改造基因组的影响,但是包括癌症和自闭症在内的疾病与另一个基本的生物分子---RNA---存在的缺陷相关联。”(生物谷 Bioon.com)

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Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9

doi:10.1016/j.cell.2016.02.054

David A. Nelles, Mark Y. Fang, Mitchell R. O’Connell, Jia L. Xu, Sebastian J. Markmiller, Jennifer A. Doudna, Gene W. Yeo

RNA-programmed genome editing using CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has enabled rapid and accessible alteration of specific genomic loci in many organisms. A flexible means to target RNA would allow alteration and imaging of endogenous RNA transcripts analogous to CRISPR/Cas-based genomic tools, but most RNA targeting methods rely on incorporation of exogenous tags. Here, we demonstrate that nuclease-inactive S. pyogenes CRISPR/Cas9 can bind RNA in a nucleic-acid-programmed manner and allow endogenous RNA tracking in living cells. We show that nuclear-localized RNA-targeting Cas9 (RCas9) is exported to the cytoplasm only in the presence of sgRNAs targeting mRNA and observe accumulation of ACTB, CCNA2, and TFRC mRNAs in RNA granules that correlate with fluorescence in situ hybridization. We also demonstrate time-resolved measurements of ACTB mRNA trafficking to stress granules. Our results establish RCas9 as a means to track RNA in living cells in a programmable manner without genetically encoded tags.

脚注信息
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